很多人以为《鬼泣5》的时间线是线性推进的，其实游戏用了交错叙事：尼禄篇、但丁篇和V篇在前半段是同时发生的不同视角，到第10关才汇合成统一时间线。核心剧情就是维吉尔为了变强吃下禁忌果实失控，分裂成人类面V和恶魔面尤里森，最后兄弟俩在魔界决战后选择留守封印魔界树的故事。
故事起点在尤里森袭击但丁事务所那一幕。当时但丁被打得毫无还手之力，连魔剑但丁都被折断，这场战斗发生在游戏开场前一个月。尤里森是维吉尔用阎魔刀切开自己分离出的纯粹恶魔人格，保留了维吉尔的全部力量和战斗记忆，目标是吃掉魔界树果实成为新的魔王。而人类面V因为太虚弱，只能召唤三只使魔战斗，他找到尼禄和但丁组队的真实目的，是等尤里森吃下果实虚弱的时候用阎魔刀把两半身体重新合一——他知道分裂状态撑不了多久，与其消亡不如赌一把完整复活。
人物关系里最关键的是尼禄的血缘：他是维吉尔的儿子，这个设定在《鬼泣4》埋了伏笔但没明说，《鬼泣5》直接挑明。游戏第8关但丁喊出”你就是你父亲的儿子”那句话，指的就是尼禄继承了维吉尔对力量的执着。尼禄的恶魔右臂在开场被尤里森扯断，是因为那只手里寄宿着阎魔刀的残留力量，尤里森需要收回这部分力量才能完全体。后来尼禄靠着对凯莉的保护欲觉醒真魔人形态，长出光翼和恶魔臂，这个形态的设定是”继承斯巴达血脉但走出自己道路”的具象化。
魔界树的机制决定了整个战役的紧迫性：这棵树扎根在城市地下，用人类血液当养分催熟禁忌果实，每过一段时间就会伸出根须吸血。游戏里那些被树根刺穿风干的尸体不是摆设，按官方设定红墓市死了上万人。尤里森吃下果实那场戏在第12关，他吃完立刻虚弱是因为果实的力量需要时间融合，V就是抓住这个空档冲上去用阎魔刀捅进尤里森体内，两半人格在刀的媒介下强行重组成完整的维吉尔。
最终章的兄弟决斗不是单纯的分胜负，是但丁用战斗逼维吉尔认清责任。两人打到筋疲力尽的时候，尼禄赶来阻止并暴揍了两个长辈一顿，这场三方混战的结局是但丁和维吉尔联手砍断魔界树的根，然后留在魔界那一侧防止树根再生。兄弟俩留守魔界这个选择，呼应了他们父亲斯巴达当年封印魔界的行为，也算是维吉尔用行动弥补自己造成的灾难。游戏片尾那本写着”Devil May Cry”的委托簿交到尼禄手里，意味着事务所的旗号正式传给下一代，但丁和维吉尔在魔界继续单挑的画面则是开放式结尾，给系列后续留了空间。